თავფურცელი

Методы биотехнологии при протезировании сосудов

 И. Ш. Микадзе, Г. А. Абзианидзе
Центр Ангиологии и Ангиохирургии ж/д Грузии

 Тяжелая ишемия нижних конечностей, обусловленная поражением артериаль­ной сис­те­мы, встречается в 50 – 75% случаев сосудистой патологии и нуждается в серьез­ных рекон­­структивных вмешательствах [4,6,9-12,16]. Проблема создания адек­ват­ных сосу­дистых заменителей за последнее десятилетие практически не изменилась. Так же остро стоит вопрос выбора адекватного сосудистого заменителя, особенно при про­те­зи­ровании со­судов среднего и малого диаметра [13,14]. Исследование причин неудач сосудистого про­те­зирования выявляет основные недостатки приживления сосу­дис­тых протезов. Оче­видно, что ключевым принципом качественного приживления сосудистого заменителя яв­ляется формирование новой сосудистой стенки обладающей естественными биологи­чес­кими защитными системами. Ограниченные возможности роста эндотелия и субэндо­те­лиальных структур на повер­хности протеза, а также отсут­ствие формирования полно­цен­ной неомедии и неоад­вентиции не в состоянии обеспе­чить качественное функцио­ниро­вание сосудистого заме­нителя.

Для обеспечения полноценного приживления сосудистого заменителя, облада­ющего естес­твенными биологическими структурами, мы использовали культивирован­ные эндо­те­ли­альные клетки (ЭК) и тканевой фактор роста (ФР) полученный из мозговой ткани парн­о­ко­пытных животных [15,17].

Материал и методы: Материалом для исследования были выбраны протезы из политетрафторэтилена (ПТФЭ) "GORE", “IMPRA”(США); тканные фторлонлавсановые протезы; биопротезы из сонной артерии крупного рогатого скота 1 ММИ им. И.М. Сеченова и “Solcograft-P”(Швейцария).

Выделение фактора роста: Фактор роста получали из мозга парнокопытных живот­ных по следующей методике: 400 g мозга гомогенизировали в течении 3 - 5 мин в 500 мл 0,15 М NaCL, затем ставили размешивать на ночь при +4⁰С. Гомогенат центрифу­гировали при 12000 g. в течении 1 часа. В надосадочную часть добавляли стрепто­мицина сульфат до 0,5% (pH доводили до 8,0) и ставили на ночь на магнитной мешал­ке в холодильник. Утром центрифугировали при 12 000 g. 1 час. Осторожно собирали супернатант и лиофили­зиро­ва­ли.

Анализ белкового состава исследуемого материала проводили на пластинах по-лиакриламидного геля, содержащего 10%- ный разделяющий и 3%-ный концентриру-ющий гель в присутствии додецил сульфата натрия.

На лунку наносили по 20-50 мкл пробы. Электрофорез проводили при силе тока 50 ма. По окончании электрофореза пластину геля погружали на ночь в 7% трихлор-уксусную кислоту для фиксации; окрашивание проводили 0.1%-ным раствором Кумас-си в течении 4-6 часов. Отмывали гель смесью спирта, уксусной кислоты и воды.

Для определения молекулярных весов полученных фракций, параллельно прого­няли белки – маркеры.

Культивирование ЭК. Культивирование, исследование прикрепления и роста ЭК, а так же покрытие внутрипросветной поверхности протезов эндотелием проводили по оригинальной методике[1, 2].

Для исследований в области культур эндотелиальных клеток в качестве куль­ту­раль­ной посуды использовались пластиковые чашки Петри диаметром 40 и 90 мм, выпус­кае­мые заводом медицинских полимеров (ОАО МЕДПОЛИМЕР (С. - Петербург)), а так же чашки Петри диаметром 35 и 60 мм, 12 и 24 ячеичные планшеты фирмы “Costar” (США).

Для культуральной работы использовали коллагеназу из гепато-панкреаса кам­чатского краба (г. Владивосток), желатин фирмы "Sigma" (США), плазменный фибро­нек­тин, произведенный в лаборатории клеточной и молекулярной кардиологии (РКНПК МЗ РФ), органический HEPES буфер и антитела к кроличьим иммуногло­булинам, меченные флуоресцеин-изотиацианатом, и кроличьи антитела к фактору VIII свертывания крови “Boeh­ring Diagnostic” (США), среда 199 предприятия по производ­ству бактерийных пре­па­ратов центрального научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.М. Мечникова.

Стерильность растворов достигалась последовательным фильтрованием через фильт­ры с размером пор 0,45 и 0,22 мкм фирмы “Millipor”(США).

Для получения ЭК человека были использованы вена пупочного канатика (550 выделений), большая подкожная вена бедра (106 выделений).

Фазовоконтрастную микроскопию производили на микроскопе “Diaphot – TMD Photo­microscope” фирмы “Nicon” (Япония), Биолам П – 1, ЛОМО (Ленинград).

Сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) производили на микроскопе PSEM – 500 фирмы “Philips” (Голландия), ” Chirana” (Чехословакия).

Определение митогенной активности полученного фактора роста в культуре ЭК. Для определения митогенной активности полученного фактора роста, мы исследовали воз­действие его разных концентраций и гепарина в соотношении 2:1 на рост ЭК человека.

На обработанную желатином чашку Петри диаметром 40 мм, высеивали ЭК пупоч­ной вены человека в количестве 30 х 10³ – 35 х 10³ клеток, которые получали из моно­слой­ной культуры и культивировали при одинаковых условиях. Клетки снимали трипсином и подсчитывали через 24, 48, 72 часа.Для определения пролиферативного пула считали все клетки культуры включая мертвые клетки после обработки трип­сином.

Покрытие протезов ЭК. Нанесение культивированных ЭК на внутрипросветную поверхность протеза проводили по описанной нами ранее методике [2]. Для этой цели был сконструирован прибор, вращающий протез, заполненный суспензией ЭК в гори­зон­тальной плоскости вокруг своей оси с частотой вращения от 0,05 до 1 об/мин.

Нанесение ФР па сосудистый протез. Протезы проводили через батарею спиртов, 30-50-90-100⁰, по 5 минут в каждой концентрации. После чего протезы высушивались на воз­­духе в течение 2 - 3 минут и помещались в гепаринизированную аутоплазму. ФР был до­бавлен в аутоплазму в четырех различных концентрациях: 10.0 мг % – 5.0 мг % ­­- 0.5 мг % - 0.05 мг %. При необходимости, избыточное действие гепарина убирали добавлением про­тамин сульфат натрия, после чего наступала полимеризация фибрина.

На следующий день протезы имплантировались в организм животного.

Операции. Экспериментальная оценка эндотелизированных артериальных биотранс­план­татов, а так же протезов обработанных ФР была произведена на беспо­род­ных соба­ках весом от 15 до 25 кг. Для исследования эндотелизированных биопротезов было прои­зведено 78 операций - протезирование брюшной аорты. Для экспериментальной апробации полученных трансплантатов обработанных ФР было произведено протезирование сонных артерий (54), протезирование бедренных артерий (50), протезирование инфраренального отдела брюшной аорты (178), торакоабдоминальное шунтирование (13).

Ре­зуль­та­ты: Полученный ФР содержит не менее 13 белковых компонентов, с молекулярными мас­сами в пределах 20×10³-70×10³ Da. Осадок полученного ФР при электрофорезе на агарозном геле дает одну фракцию, расположенную соответственно самым высокомолекулярным фракциям РВR – 322 и Hind III. Следовательно ДНК исследуемого материала имеет молекулярный вес порядка 5.6 MD. Количество эндо­телиа­льных клеток культуры с использованием в полной среде роста полученного митогена в концентрации 100 мкгр/мл через 24 часа составило 40.4±3.3X 10³ и увеличилось вдвое че­рез 48 часов и составило 65.7±3.4X10³ (р<0.05). Увеличение концентрации ФР до 200 мкгр/мл приводит к увеличению количества клеток вдвое уже через 24 часа (60.3±1.8 X10³). Экспоненциальность роста сохраняется в последующем и количество клеток через 48 часов равно 100.2±9.2 X 10³ и через 72 часа 240.2±2.0 X 10³. Количество клеток с использованием в полной среде роста митогена в концентрации 400 мкгр/мл через 24 часа составило 55.4±7.4 X 10³ и досто­вер­но не отличалось от количества клеток через 24 часа при использовании ФР в кон­центрации 200 мкгр/мл. При использовании этой концен­тра­ции митогена ЭК в куль­туре сохраняют экспоненциальный рост: количество клеток через 48 часов культи­вирования составило 110.4±10.8X10³ и через 72 часа 230.1±4.0X10³. Увеличение концентрации ФР до 600 мкгр/мл не привело к увеличению коли­чества клеток. Количество клеток через 48 и 72 часа в срав­нении с использованием митогена в конце­н­трациеи 400 мкгр/мл уменьшилось и составило 85.7±6.6X10³ и 160.0±2.0X10³ против 110.4±10.8X10³ и 230.1±4.0 X 10³ соответственно.

Экспериментальная оценка: Экспериментальная оценка эндотелизированных арте­риальных биотранспланта­тов. При частоте вращения протеза с суспензией эндо­те­ли­альных клеток, равной 0,05 об/мин., плотность прикрепившихся клеток приближается к монослойной (0,95±0,15 ×10⁶ кл/см²). Эндотелизированные ксенопротезы (38 и 40 экспериментов) были вшиты в брюшную аорту собак. Морфологическое изучение функ­цио­нирующих в брюшной аорте собак эндотели­зи­рованных ксенопротезов показало, что во всех случаях, начиная с 3 дня после им­план­тации, формируется неоинтима. Основой ее формирования являются эндоте­лиальные клетки искусственно нанесенные на поверхность протеза. Если спустя три дня после имплантации эндотелиальный монослой еще не плотный, сквозь разобщен­ные клетки просматривается структура протеза, то через неделю клетки плотно покрывают поверхность протеза. Уже через 3-7 дней после имплантации формируется адвентиция протезов, в которой в большом количестве обнаруживаются vasa vasorum. К этому сроку вся тол­ща протеза инфильтрирована клетками мезенхимального ряда. Под эндотелиальной выстилкой располагаются гладкомышечные клетки, которые по отношению к эндотелию имеют вертикальное расположение. Толща ксенопротезов про­рас­тает фибро­бластами, которые ориентированы вдоль длинной оси протеза. Люми­нальная поверхность спустя 14 дней после имплантации продолжает транс­формироваться. Клетк­и имеют ориентацию по потоку крови. Эндотелиальный пласт плотный, сквозь который не видны соединительнотканные волокна. На ксенопротезе "Solcograft-P" спустя 60 дней после имплантации внутренняя поверхность эндоте­лизи­ро­ван­ных ксенопротезов "Solcograft-P" макроскопически не отличается от внутренней повер­хнос­ти аорты. Цент­раль­ная часть ксенопротеза "Solco­graft-P" к этому времени образует скла­дчатую пове­р­хность с направлением складок по току крови. Четко определяются ядер­ные возвышения, как на самих складках, так и в межскладочных углублениях. Пов­ер­хность протеза сво­бодна от наложений фибрина и клеточных элементов крови (Рис. 1).

Спустя 180 дней после имплантации люминальная поверхность эндотели­зи­рованного протеза "Solcograft-P" практически не отличается от поверхности нор­мальной аорты. Меж­скла­дочные углубления приблизительно одинаковы и в среднем равны ширине этих скла­док. Ядерные возвышения менее выражены.

Экспериментальная оценка артериальных трансплантатов обработанных ФР in vivo.

Первая и вторая группа животных (42 эксперимента). Протезы обрабатывались р-ром аутоплазмы содержащей 10 мг%(0.05 мг / см² протеза); и 5 мг% ФР(0.025 мг / см² протеза).

В этих группах протезы тромбировались на протяжении первых двух недель после имплантации, начиная с первого дня. При использовании протезов из ПТФЭ и фторлон­лав­сана в первые дни после имплантации отмечалось формирование нео­интимы по тол­щи­не многократно превосходящей толщину протеза. Неоинтима в данном случае пре­дстав­ляет собой пристеночный тромб на разных стадиях орга­низации.

Третья группа животных (113 экспериментов).

Фактор роста был добавлен в аутоплазму в количестве 0,5 мг %(0.0025 мг / см² протеза).

Неоваскуляризация протезов начинается с первых дней после имплантации. При ис­поль­зовании протезов из ПТФЭ и фторлонлавсана на 7 - 10 сутки отмечается хо­рошо сфор­­мированная пронизанная vasa vasorum неоадвентиция, плотно прилега­ющая к повер­хнос­ти протеза. Толщина неоинтимы составляет 0.25 - 0.5 мм и не имеет тенден­цию к уве­ли­чению в позиции брюшной аорты. Толща протеза пронизана клетками мезенхимального ряда. Исследования с помощью сканирующей электронной микроско­пии показали, что через две недели в позиции брюшной аорты область анастомозов пол­ностью покрыта плотным клеточным слоем, имеющим одинаковое строение по сравнению с клеточным покрытием аорты. Протезы в позиции сонных и бедренных ар­те­рий тромбировались в течении первой недели после имплантации.

Четвертая группа животных (136 экспериментов).

Фактор роста был добавлен в аутоплазму в количестве 0,05 мг % (0.0025 мг/см² протеза). Проходимость протезов составила 90 % на протяжении 6 месяцев после имплан­тации.

В течении первых двух недель анастомозы протезов гладкие, блестящие, цвет не отличается от цвета интимы протезируемого сосуда на протяжении 1,5 - 2.0 см. от анас­то­мозов. Не отмечается сужения просвета протеза и в позиции сонных и бедрен­ных артерий, где диаметр протеза был 4 мм. Поры протеза заполнены фибро­бластами, глад­ко­мышеч­ными клетками, которые переходят на внутрипросветную поверхность про­те­­за, где уже сформирована неоинтима.

Анастомозы протезов без признаков гиперплазии. Организованная неоинтима в месте клиновидного тромба тонкая, покрыта эндотелиальными клетками, нарастающи­ми со стороны артерии. Складчатость поверхности артерии переходит на поверхность протеза.

Центральная часть протезов имеет белесоватый вид, на фоне которого отме­чяются единичные точечные наложения красного цвета. В центре протеза от­ме­чается клеточная организация неоинтимы. Клетки продолговатой формы,­ на­­п­рав­ле­­ны по току крови и сос­тов­ляют плотный монослой (Рис.2). Фторлон-лавсановые протезы оставались прохо­ди­мыми на протяжении исследуемого периода - 180 дней, в 100 % случаев. Начиная с первых дней после имплантации формирование неоангиогенеза про­­хо­­дило по аналогичному пути. Уже через месяц, внутрипросветная поверхность протезов покрыта организованной неоинтимой с эндотелиальным моно­слоем.

Обсуждение: Исследование причин неудач сосудистого протезирования выявляет основные не­дос­тат­ки приживления сосудистых протезов. Очевидно, что ключевым принципом ка­чес­твен­но­го приживления сосудистого заменителя является формирование новой сосудистой стен­ки обладающей естественными биологическими защитными система-ми. Огра­ничен­ные возможности роста эндотелия и субэндотелиальных структур на поверх­ности протеза, а также отсутствие формирования полноценной неомедии и нео-адвентиции не в состоянии обеспечить качественное функционирование сосудистого заменителя. Использование биологических технологий при трансплантации сосудов обеспечивает естественные пути роста структур сосудистой стенки.

Рис. 2. Внутренняя поверхность ПТФЭ протеза обработанного ФР спустя 180 дней после имплантации. Четвертая группа животных. СЭМ. Увел.160

Культивированный эндотелий нанесенный на поверхность сосудистого протеза после имплантации в организм является мощным регулятором роста сосудистой стен­ки. Нет никакого сомнения, что прижившиеся эндотелиальные клетки способны функ­цио­нировать на поверхности протеза. Если в контрольных протезах, обязательным усло­вием для формирования эндотелиального монослоя является формирование на его поверхности соединительной ткани [3,5,7,8], то в нашем случае эндотелий сам формирует базальную мембрану и оказывает стимулирующее влияние на приживление протеза. Формирование неоинтимы не может происходить изолированно и тесно свя­зана с формированием двух других слоев: неомедии и неоадвентиции. Отсутствие ригид­ной соединительно-тканной капсулы вокруг протеза является предпосылкой для формирования эластических структур стенки сосудистого заменителя. Очевидно, что соединительно-тканная капсула не формируется из за того, что протез уже окружен с одной стороны эндотелием и с другой стороны рыхлой неоадвентицией с большим количеством vasa vasorum и микрососудистой сетью. Наличие полноценного эндоте­лия, как на внутрипросветной поверхности, так и в перипротезных тканях обеспечивает нормальное функционирование протеза с одной стороны и является гарантом саморе­гуляции процессов регенерации сосудистой стенки.

Одной из основных задач современной медицины является определение меха­низ­мов роста и пролиферации клеток, а так же изучение возможности регуляции направленного роста клеток и тканей в организме. По нашему мнению, последова­тельный рост струк­турных элементов артериальной стенки, стимулирован-ный на ран­них этапах приживления протеза способен формировать функционально полноценный новый кровеносный сосуд. В качестве митогена нами был выделен ФР из головного мозга теленка.

Семейство ФР фибробластов включает, по меньшей мере, девять членов(FGF-1-9), которые имеют широкий спектр действия. Mолекулярная масса фактора роста фибро­бластов колеблется от 14 до 18 kDa.[4,6]. Полученная субстанция содержит не менее 13 белковых компонентов, с молекулярными массами в пределах 20-70 kDa и не является ФР фибробластов. Митогенная активность по отношению к ЭК и клеткам мезен­хи­мального ряда позволяет использовать полученный ФР, как митоген для клеток мезенхимального ряда.

Исследования показали, что полученный фактор роста обладает митогенной актив­нос­тью по отношению к эндотелиальным клеткам во всех исследуемых концент­рациях. Наи­более эффективной концентрацией ФР является 200 – 400 мкгр/мл в сочетании с 100 – 200 мкгр/мл гепарина. Необходимо отметить, что ни в одном случае не отмечечалось не­контролируемого роста клеток.

Высокая концентрация фактора роста способствует откладыванию фибрина на по­верх­ности протеза и стимулирует чрезмерных рост клеток перипротезных тканей, что препятс­твует развитию процессов неоангиогенеза. Снижение концентрации ФР в стенке протеза позволяет достич умеренной стимуляции роста ЭК как со стороны протезируемой артерии, так и микрососудистого эндотелия. Раннее формирование эндотелиальной выс­тил­ки является предпосылкой для полноценного приживления протеза.

Использование ФР для приживления сосудистых протезов обеспечивает детерми­ниро­ванный рост клеток сосудистой стенки. Стимулирование роста клеток перипротезных тканей ускоряет приживление сосудистых заменителей, формирует нео­интиму покрытую монослоем эндотелиальных клеток раньше чем там будет сформи­рована фиброзная кап­сула. Клеточная организация неоинтимы становится возможной в отсутствии грубой сое­дини­тельной ткани на внутрипросветной поверхности протеза.

 Литература:

1.      Абзианидзе Г.А., Микадзе И.Ш.; Молдобаева А.К.; и др. Эндотелизация сосудистых протезов культивируемыми эндотелиальными клетками человека// Хирургия,- 1989 - N.6,- С.124-128.

2.      Абзианидзе Г.А., Микадзе И.Ш., Меликадзе К.Н. Экспериментальное исследование по искусственной эндотелизации сосудистых трансплантатов// Мацне. Известия Акад. Наук Грузии. Серия биологическая.- 1994 .-Т.20.- N.1-6.- С. 81-87.

3.      Джавахишвили Н.А. Морфологический анализ реконструированной артерии //.-В кн. Проблемы сосудистой трансплантологии.-Тбилиси.-1990.-С.165-166.

4.      Каримов Ш.И., Ганиев А.М., Кротов Н.Ф.//Интраоперационная дилатация подвздошно-бедренного сегмента в сочетании с реконструктивными вмешательствами на бедренных артериях при многоэтажных поражениях у больных группы риска // Хирургия.- 1990.- N.11.-С.-37-40.

5.      Кислиновская Н.В., Новикова С.П. Текстильные сосудистые протезы с биодеградируемым полимерным покрытием.// Грудная и сердечно-сосудистая хирургия.-1996.-N.6.-С.-254.

6.      Кунгурцев В.В.Мнусский Д.Е., Дибиров М.Д. Улучшение результатов реконструктивных операций при облитерирующих заболеваниях артерий нижних конечночтей //-Хирургия. - 1987. - N.12. - С. 26 -30.

7.      Лебедев Л.В., Плоткин Л.Л., Смирнов А.Д. Протезы кровеносных сосудов// Ленинград, “Медицина” Ленинградское отделение.-1981.-С.52-64.

8.      Новикова С.П. Способы повышения тромборезистентности полимерных поверхностей // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия.-1996.-N6.-С.-257.

9.      Abou-Zamzam A. M., Jr., MD, Lee R. W., MD, Moneta G. L., MD,. et al., Functional outcome after infrainguinal bypass for limb salvage// J. Vasc. Surg .-1997.-25.-P.287-297.

10.  Clagett, G. Patrick, Valentine R. James and Ryan T. Hagino Autogenous aortoiliac/femoral reconstruction from superficial femoral popliteal veins: Feasibility and durability // J. Vasc. Surg.-1997.-25.-P.255-270.

11.  Chang John B., Stein Theodore A., Liu, Julie P. and Mary Ellen Dunn. Long-term results with axillo-axillary bypass grafts for symptomatic subclavian artery insufficiency // J Vasc Surg.-1997.-25.-P.-173-178.

12.  Fahal A.H., McDonald A.M., Marston A. Femoro-femoral bypass in unilateral iliac artery occlusion // Br. J. Surg.-1989.- Vol.76.- N.1.-P.22-25.

13.  Loftus I. M., A. Reid, M. M. Thompson, N. J. M.et al., The Increasing Workload Required to Maintain Infrainguinal Bypass Graft Patency// Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg.- April 1998.- Vol. 15, N. 4.- P. 337-341.

14.  Minn K.V., Serafin D., Mikat E., Klitzman B. //Reconstruction of rat femoral veins with microvascular prostheses //Plast. Reconstr. Surg.-1991.- Vol.87.-N.3.-P.536-542.

15.  Miyamoto M., et al. //Fibroblast Growth Factor – 9//Mol. Cell. Biol.-1993.-N.13.-P.4251-4260.

16.  Schror K., Hecker G. Different Effekt of E – and I – Type Prostaglandins on human Platelet and Polymorphonuclear Cell Function // In Book “Prostaglandin E1 in Atherosclerosis, Helmut Sinzinger, Waltraud Rogatti (Eds).-1986.-Munich.-P.22 – 31.

17.  Thomas K. A., Rios-Candelore M., Gimenez-Gallego G.,et al., Pure brain-derived acidic fibroblast grwth factor is a potent angiogenetic vascular endothelial cell mitogen Wth sequence homology to interleukin// Proc. Natr. Acad. Sci.-1985.- Vol.82.-P.6409-6413.

თავფურცელი